Evaluation of Toxocara canis Glycosylated TES Produced in Pichia pastoris for Immunodiagnosis of Human Toxocariasis

Abstract Recombinant proteins are a suggested alternative for the diagnosis of toxocariasis. The current Escherichia coli recombinant protein overexpression system usually produces insoluble products. As an alternative, yeast such as Pichia pastoris have secretory mechanisms, which could diminish the cost and time for production. This study aimed to produce recombinant proteins in Pichia pastoris and verify their sensibility and specificity in an indirect ELISA assay. Two sequences (rTES-30 and rTES-120) of Toxocara canis excretory-secretory antigens were cloned in a pPICZαB vector and expressed in P. pastoris KM71H. Sera samples collected from human adults infected by Toxocara spp. were tested by indirect ELISA using rTES-30 and rTES-120 as antigens. Recombinant proteins were detected at 72 hours after induction, in the supernatant, as pure bands between 60~70 kDa with hyperglycosylation. Regarding diagnosis potential, recombinant antigens had high specificity (95.6%); however, sensitivity was 55.6% for rTES-30 and 68.9% for rTES-120. Further deglycosylation of the P. pastoris antigens did not seem to affect ELISA performance (p>0.05). The low sensitivity in the serodiagnosis diminished any advantage that P. pastoris expression could have. Therefore, we do not recommend P. pastoris recombinant TES production as an alternative for the diagnosis of toxocariasis.

Evaluation of Pregnant and Postpartum Women´s Knowledge about Toxoplasmosis in Rio Grande - RS, Brazil / Avaliação do conhecimento de gestantes e puérperas sobre a toxoplasmose na cidade do Rio Grande - RS, Brasil

Abstract Introduction Toxoplasmosis a parasitic zoonosis of global distribution, responsible for disorders during gestation can cause fetal death or congenital anomalies. Objective To evaluate the knowledge of toxoplasmosis among pregnant and postpartum women treated at the University Hospital of the city of Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brazil. Methods This was a cross-sectional study of 100 pregnant and postpartum women at the University Hospital. Participants answered a self-administered questionnaire and gave consent for data relating to serological examinations to be abstracted from their medical records. Results The proportion of women who received information about toxoplasmosis was higher among those who received care in the private health care system (52.9%) than among those cared for in the public health care system (25.0%). Only 55.7% of women reported having some knowledge about toxoplasmosis. Of these, 53.7% received information during the prenatal period. However, most participants were unable to answer questions about preventive measures and modes of infection. Of the 100 patients in the study, only 46 underwent serologic testing for toxoplasmosis, 65.2% of whom tested negative (IgG). Conclusion Findings from this study are relevant to the training of health professionals regarding toxoplasmosis education and prevention. Improved education for health care providers and patients can lead to earlier diagnoses and reductions in adverse outcomes.

Resumo Introdução A toxoplasmose é um parasita zoonose com distribuic¸ão global, responsável por enfermidades durante a gestac¸ão que podem causar o óbito do feto ou anomalias congênitas. Objetivo Avaliar o conhecimento sobre toxoplasmose das gestantes e puérperas atendidas no Hospital Universitário da cidade de Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil. Método Estudo transversal sobre o conhecimento de 100 gestantes/puérperas no Hospital Universitário. A participação do sujeito da pesquisa consistiu em responder a um questionário autoaplicável e em autorizar o acesso ao seu prontuário e à sua carteira de pré-natal, nos quais foram pesquisados dados referentes aos exames sorológicos realizados. Resultados O percentual de mulheres que receberam informações sobre toxoplasmose foi maior nas atendidas no sistema de saúde privado (52,9%). Somente 55,7% afirmaram ter algum conhecimento sobre a toxoplasmose. Destas, 53,7% receberam informação durante o pré-natal. Entretanto, a maioria das participantes não soube responder sobre as medidas preventivas e formas de infecção da toxoplasmose. Das 100 pacientes, apenas 46 realizaram o teste sorológico para toxoplasmose, e destas, 65,2% apresentaram resultado negativo. Conclusões Comisso, torna-se relevante o incentivo à educação em saúde dentro das instituições em todos os momentos do pré-natal, e a capacitação dos profissionais frente às gestantes e puérperas acerca da toxoplasmose, abrangendo desde a educação em saúde até a realização do diagnóstico precoce.

ANTHELMINTIC ACTIVITY OF LAPACHOL, β-LAPACHONE AND ITS DERIVATIVES AGAINST Toxocara canis LARVAE / Atividade anti-helmíntica do lapachol, β-lapachona e derivados contra larvas de Toxocara canis

Anthelmintics used for intestinal helminthiasis treatment are generally effective; however, their effectiveness in tissue parasitosis (i.e. visceral toxocariasis) is moderate. The aim of this study was to evaluate the in vitro activity of lapachol, β-lapachone and phenazines in relation to the viability of Toxocara canis larvae. A concentration of 2 mg/mL (in duplicate) of the compounds was tested using microculture plates containing Toxocara canis larvae in an RPMI-1640 environment, incubated at 37 °C in 5% CO2 tension for 48 hours. In the 2 mg/mL concentration, four phenazines, lapachol and three of its derivatives presented a larvicide/larvistatic activity of 100%. Then, the minimum larvicide/larvistatic concentration (MLC) test was conducted. The compounds that presented the best results were nor-lapachol (MLC, 1 mg/mL), lapachol (MLC 0.5 mg/mL), β-lapachone, and β-C-allyl-lawsone (MLC, 0.25 mg/mL). The larvae exposed to the compounds, at best MLC with 100% in vitro activity larvicide, were inoculated into healthy BALB/c mice and were not capable of causing infection, confirming the larvicide potential in vitro of these compounds.

Os anti-helmínticos empregados no tratamento das helmintoses intestinais, de modo geral, são eficazes, porém nas parasitoses teciduais, como é o caso da toxocaríase visceral, a eficácia é moderada. Este estudo teve como objetivo avaliar in vitro a atividade do lapachol, β-lapachona e fenazinas derivadas da β-lapachona sobre a viabilidade de larvas de Toxocara canis. Os compostos foram testados na concentração de 2 mg/mL (em duplicata) em placas de microcultivo, contendo larvas de T. canis em meio RPMI-1640, sendo incubados, a 37 °C, em tensão de CO2 de 5%, por 48 horas. Na concentração de 2 mg/mL, quatro fenazinas, o lapachol e três derivados, apresentaram atividade larvicida/larvostática de 100%. A seguir, foi realizado o teste de concentração larvicida/larvostártica mínima (CLM). Os compostos que apresentaram os melhores resultados foram o nor-lapachol (CLM, 1 mg/mL), lapachol (CLM, 0,5 mg/mL), a β-lapachona e a β-C-alil-lausona (CLM, 0,25 mg/mL). As larvas expostas aos compostos, na melhor CLM 100% in vitro foram inoculadas em camundongos BALB/c saudáveis não sendo capazes de causar infecção, confirmando o potencial larvicida in vitro desses compostos.

Elevated trans-mammary transmission of Toxocara canis larvae in balb/c mice / Elevada transmissão transmamária de larvas de Toxocara canis em camundongos BALB/c

Toxocariasis is a widespread zoonosis and is considered an important worldwide public health problem. The aim of this study was to investigate the frequency of trans-mammary Toxocara canis infection in newborn BALB/c mice nursed by females experimentally infected with 1,200 eggs after delivery. After 50 days of age, the presence of larvae in different organs of the offspring was investigated. Trans-mammary infection was confirmed in 73.9% of the mice that had been nursed by infected females. These data show a high trans-mammary transmission of T. canis and confirm the significance of this transmission route in paratenic hosts.

A toxocaríase é zoonose amplamente difundida e considerada importante problema de saúde pública. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência da transmissão transmamária de Toxocara canis em camundongos BALB/c neonatos amamentados por fêmeas experimentalmente infectadas com 1.200 ovos logo após o parto. Após 50 dias de idade, foi avaliada a presença de larvas em diferentes órgãos dos neonatos. A infecção por via transmamária foi confirmada em 73,9% dos camundongos amamentados por fêmeas infectadas. Estes dados demonstram elevada transmissão transmamária de T. canis e confirmam a importância desta via de transmissão em hospedeiros paratênicos.

Determination of IgG avidity in BALB/c mice experimentally infected with Toxocara canis / Determinação da avidez de IgG em camundongos BALB/c experimentalmente infectados com Toxocara canis

Toxocariasis is a zoonotic disease in that IgM titers can remain high for long periods making difficult to determine the stage of the disease. The aim of this study is to investigate the applicability of indirect ELISA, associated with urea, to discriminate between the acute and chronic toxocariasis. IgG avidity was evaluated in 25 BALB/c mice experimentally infected with 1000 Toxocara canis eggs. Blood samples were collected, and sera treated with 6 M urea and assayed by ELISA every two weeks. The percent IgG avidity was determined using the mean absorbance of sera treated with urea, divided by the mean absorbance of untreated sera. In the first 15 days post-inoculation, was observed a low percentage, between 7.25 and 27.5%, IgG avidity, characteristic of an acute infection. After 60 days of infection, all the mice showed between 31.4 and 58% IgG avidity, indicating a chronic infection.

A toxocaríase é uma zoonose na qual os títulos de IgM podem permanecer elevados por longos períodos, tornando difícil a determinação do estágio em que a doença se encontra. O objetivo deste estudo foi investigar a aplicabilidade de um teste indireto de ELISA, associado com ureia, para fazer a discriminação entre as fases aguda e crônica da toxocaríase. A avidez de IgG foi avaliada em 25 camundongos BALB/c experimentalmente infectados com 1000 ovos embrionados de Toxocara canis. A cada duas semanas, amostras de sangue foram coletadas, o soro tratado com ureia 6M e realizado o ensaio pela técnica de ELISA. O percentual de avidez de IgG foi determinado, usando-se a média das absorbâncias dos soros tratados com ureia dividida pela média das absorbâncias dos soros não tratados. Nos primeiros 15 dias pós-inoculação, foi observado um baixo percentual de avidez de IgG, entre 7,25 e 27,5%, característico da fase aguda da infecção. Após 60 dias de infecção, todos apresentaram avidez de IgG entre 31,4 e 58%, indicando a fase crônica da infecção.

Giardia lamblia: diagnóstico com o emprego de métodos microscópicos e Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) / Giardia lamblia: diagnosis using microscopic methods and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

O protozoário Giardia lamblia é um dos agentes etiológicos de diarreia em crianças no Brasil.Seu diagnóstico pode tornar-se difícil em consequência da baixa sensibilidade dos métodosusualmente empregados e por causa da eliminação intermitente dos cistos pode produzir resultadosfalso-negativos. Por essa razão, foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático (ELISA) parapesquisa de antígenos de G. lamblia em fezes. Este imunoensaio tem sido descrito na literatura comoum método simples, sensível e específico quando aplicado para o diagnóstico de diversas parasitoses.Assim, este estudo objetivou comparar a técnica de ELISA com os métodos coproscópicos decentrífugo-sedimentação (Técnica de Ritchie) e centrífugo-flutuação (Técnica de Faust), visandodemonstrar a importância de um método com maior sensibilidade. Foram examinadas 158 amostrasde fezes de crianças, de 0 a 12 anos, em uma creche municipal pública de Rio Grande, no RioGrande do Sul, Brasil. Os resultados referentes à comparação entre as técnicas mostraram que atécnica de ELISA tem 3,0 vezes mais chances de detectar amostras positivas de G. lamblia que ométodo de centrífugo-flutuação. Quando comparada com o método de centrífugo-sedimentação,a técnica de ELISA demonstrou ter 3,4 vezes mais chances de detectar amostras positivas para G.lamblia.Concluiu-se que a técnica de ELISA desenvolvida mostrou-se mais eficiente que as técnicasadotadas na rotina laboratorial para o diagnóstico desta parasitose, podendo ser aplicada tanto parao diagnóstico individual como em avaliações epidemiológicas, já que permite o processamento devárias amostras simultaneamente.

The protozoan Giardia lamblia is one of the etiological agents of diarrhea in children in Brazil, anddiagnosis may be difficult due to low sensitivity of the methods commonly used, due the intermittentliberation of cysts, which may lead to false-negative results. Thus, an enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA) was developed for detection of G. lamblia antigens in fecal samples, consideringthat this immunoassay has been described to be simple, sensitive and specific when applied todiagnose various parasitic diseases. Thus, this study aimed to compare the ELISA technique withsingle stool sample to examination methods using centrifugal sedimentation (Ritchie technique) andcentrifugation-flotation (Faust technique), intending to demonstrate the importance of a method withgreater sensitivity. Fecal samplesfrom a total of 158 children aged 0-12 years, were examined in apublic municipal nursery in the city of Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brazil. The comparative resultsof the investigated techniques showed that ELISA has 3.0 times more chance than centrifugationflotation,and 3.4 times more chance than centrifugal sedimentation to detect positive samples ofG. lamblia. Overall, it was concluded that the ELISA was more efficient than the routine laboratorytechniques for the diagnosis of giardiasis, and it may be used for both individual and epidemiologicalassessments, as the technique allows for processing of multiple samples simultaneously.

Vertical transmission of Toxocara canis in successive generations of mice / Transmissão vertical de Toxocara canis em gerações sucessivas de camundongos

Visceral toxocariasis is a neglected zoonosis caused by Toxocara canis larvae in unusual hosts. In dogs, the definitive host, the infection occurs mainly through transplacental and transcolostral transmission. Studies on experimental models have shown that vertical transmission may result from acute infections. Considering that toxocariasis is characterized as a chronic infection, with possible reactivation of larvae present in the brain, this study evaluated the presence of larvae in the brain of female BALB/c mice and their offspring with chronic infection during three successive pregnancies. ELISA-TES was used to evaluate the antibody levels. T. canis larvae were detected in the brain tissue of the mice during the three successive generations evaluated. The offspring's IgG level gradually decreased, and mean absorbance (ABS) above the cutoff point (0.070) was observed only at 30 (0.229) and 50 (0.096) days of age, while IgM was not detected. The infections in the offspring confirmed that vertical transmission of T. canis larvae occurred during chronic toxocariasis in three successive generations of mice.

A toxocaríase visceral é uma zoonose negligenciada causada por larvas de Toxocara canis em hospedeiros não usuais. Em cães, os hospedeiros definitivos, a infecção ocorre normalmente por transmissão transplacentária e através do colostro. Estudos com modelos experimentais têm demonstrado a ocorrência de transmissão vertical durante a infecção aguda. Considerando que a toxocaríase é caracterizada como uma infecção crônica, com uma possível reativação das larvas presentes no cérebro, este estudo avaliou a presença de larvas no cérebro de camundongos Balb/C fêmeas e suas proles com infecção crônica durante três gestações sucessivas. Para avaliar os níveis de anticorpos foi utilizado ELISA-TES. Larvas de T. canis foram detectadas no encéfalo dos animais durante as três gerações sucessivas avaliadas. O nível de IgG das proles foi diminuindo gradualmente e as médias de absorbâncias (ABS) acima do ponto de corte (0,070) foram evidenciadas somente aos 30 (0,229) e 50 dias (0,096) de vida, enquanto que não foi detectada IgM. Infecções das proles confirmam a transmissão vertical de larvas de T. canis durante a toxocaríase crônica em três gerações sucessivas de camundongos.

Prevalência de enteroparasitas em crianças atendidas em unidades básicas de saúde em uma cidade do sul do Brasil / Prevalence of enteroparasites in children attended at basic health unities in a Brazilian southern city

As helmintoses e protozooses intestinais constituem sério problema de saúde pública nos países emdesenvolvimento. Este estudo analisou a prevalência de parasitas intestinais em crianças pré-escolaresatendidas em Unidades Básicas de Saúde (UBS) na cidade do Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil.Foram examinadas amostras de fezes de 144 crianças, no período de outubro de 2009 a março de 2010.A prevalência de parasitas patogênicos foi de 17,4 %, em que foram detectados ovos dos nematoidesAscaris lumbricoides (11,1 %) e Trichuris trichiura (6,3 %), e cistos do protozoário Giardia lamblia (4,9 %).Foram também identificados cistos de protozoários considerados não patogênicos, como Entamoeba coli,Endolimax nana e Enteromonas hominis, em 28,5 % das crianças. Em relação às prevalências nas UBS, aspositividades foram de 36,4 % na UBS-1, 11,1 % na UBS-3, 14,8 % na UBS-4, 8 % na UBS-5 e 19,2 % naUBS-6. Na UBS-2 não foi detectada positividade nas amostras de fezes analisadas. A prevalência de parasitaspatogênicos registrada na população estudada sugere a ocorrência de prováveis condições de reinfecção e anecessidade de implementar medidas de saneamento básico e de programas que possibilitem a melhoria dacondição de vida dessas crianças.

Evaluation of diagnostic methods for the detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy specimens of dyspeptic patients

Helicobacter pylori infects nearly 50% of the world's population. This microorganism is accepted as the most important agent of gastritis and as a risk factor for peptic ulcer disease and gastric adenocarcinoma. Currently many diagnostic methods exist for detecting H. pylori, however they all have limitations, thus it is recommend a combination of at least two methods. The aim of this study was to evaluate diagnostic methods, such as in-house urease test, culture and Polymerase Chain Reaction (PCR), for the detection of the H. pylori in gastric biopsy specimens of 144 dyspeptic patients, using as gold standard the association between histology and rapid urease test. According to the gold standard used in this study, 48 (33.3%) patients were infected with H. pylori, while 96 (66.7%) were classified as not infected. The in-house urease test and the PCR were the most sensitive methods (100%), followed by culture (85.4%). However, the in-house urease test and the culture were the most specific (100%), followed by PCR (75%). In conclusion, this study showed that, in comparison with the combination of histology and rapid urease test, the in-house urease test and the PCR presented 100% of sensitivity in the diagnosis of gastric infection by H. pylori, while the in-house urease test and the culture reached 100% of specificity. These finding suggest that the combination of two or more methods may improve the accuracy of the H. pylori detection.

Improving tuberculosis control through the partnership between university and the health system / Qualificar o controle da tuberculose mediante a parceria entre a Universidade e o Sistema de Saúde

INTRODUCTION: Tuberculosis (TB) control is linked to the availability of qualified methods for microbiological diagnostics; however, microscopy with limited sensitivity is the only method available in many locations. The objective of this study was to evaluate the introduction of culture, drug susceptibility testing (DST), and genotyping in the routine of a Municipal Program of Tuberculosis Control. METHODS: Direct microscopy of sputum and culture in Ogawa-Kudoh were performed on 1,636 samples from 787 patients. DST of positive cultures was performed by resazurin microtiter assay and genotyping by mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeat. RESULTS: A total 91 patients with TB were identified. The culture increased case detection by 32% compared with the microscopy; acquired resistance was 3.3% and the genotyping showed high genetic diversity. CONCLUSIONS: Ogawa-Kudoh contributed significantly to the increase in case detection and is suitable for implementation in poor-resource locations. The acquired resistance rate was lower than that reported in a recent Brazilian survey. The high genetic diversity is possibly related to the high TB prevalence in the population, as well as to early detection and suitable treatment of patients. The interaction between research and health care is important for reorienting the practice, transferring technology, and improving TB control.

INTRODUÇÃO: O controle da tuberculose (TB) está relacionado com a disponibilidade de métodos de diagnóstico microbiológico qualificados, no entanto a microscopia com a sua limitada sensibilidade é o único método disponível em muitos locais.O objetivo deste estudo foi avaliar a introdução da cultura, teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) e genotipagem na rotina de um Programa Municipal de Controle da Tuberculose. MÉTODOS:A baciloscopia direta do escarro e cultura em Ogawa-Kudoh foram realizadas em 1.636 amostras de 787 pacientes. O TSA das culturas positivas foi realizado pelo método de microdiluição e a genotipagem por Mycobacterial Interspersed Repetitive Units - Variable Number Tandem Repeat (MIRU-VNTR). RESULTADOS:Foram identificados 91 pacientes com TB, com a cultura aumentando em 32% a detecção de casos em comparação com a microscopia; a resistência adquirida foi de 3,3% e a genotipagem mostrou alta diversidade genética. CONCLUSÕES: O cultivo em Ogawa-Kudoh contribuiu significativamente para o aumento na detecção de casos e é adequado para ser implementado em locais com poucos recursos. A taxa de resistência adquirida foi menor do que a relatada em recente inquérito nacional. A alta diversidade genética está possivelmente relacionada à alevada prevalência de TB na população, detecção precoce e tratamento adequado dos pacientes.A interação entre a pesquisa e serviço de saúde pública é importante para reorientar a prática, transferir tecnologia e melhorar o controle da TB.

Presença de coccídios e outros enteroparasitos em uma população de crianças no município de Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil / Presence of coccidia and other intestinal parasites in a population of children in Rio Grande, Rio Grande do Sul State, Brazil

As parasitoses intestinais ainda figuram como doenças parasitárias comuns em nosso país. Acredita-se que a frequência de coccídios intestinais provavelmente seja subnotificada dada a raridade com que exames específicos para o diagnóstico destes protozoários são adotados. Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar a prevalência de enteroparasitos na população de uma creche pública em Rio Grande-RS, com ênfase nos coccídios intestinais. Dos 165 pré-escolaresexaminados, 106 revelaram-se positivos. Os parasitos prevalentes foram Giardia lamblia (30,3por cento)e Trichuris trichiura (24,2por cento), mas destaca-se o registro de Cryptosporidium spp. e Cystoisosporabelli. Os achados apontam a necessidade de implementação de medidas educacionais e de técnicasdiagnósticas específicas para diferentes protozoários.

Contaminaçäo ambiental por ovos e larvas de helmintos em fezes de cäes na área central do Balneário Cassino, Rio Grande do Sul / Environmental contamination by helminth eggs and larvae in dog feces from central area of Cassino beach, Rio Grande do Sul

Para investigar a presença de helmintos, agentes de zoonoses parasitárias, foram examinadas 237 amostras fecais de cäes, na área central do principal balneário do litoral sul do Rio Grande do Sul. As principais contaminaçöes foram: ovos e larvas do gênero Ancylostoma (71,3 por cento), ovos de Trichuris (32,5 por cento) e Toxocara (9,3 por cento)